Содержание
4 Введение
4 В живых клетках происходит синтез множества органических молекул, среди которых главную роль играют полимерные макромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды. Особая роль в жизнедеятельности живых организмов принадлежит белкам. От родителей
4 На долю белков внутри клетки приходится более половины их сухого вещества. В организме человека насчитывают около 50 000 индивидуальных белков. Видовая и индивидуальная специфичность набора белков в данном организме определяет особенности его строени
4 Полипептидные цепи за счёт внутримолекулярных взаимодействий образуют пространственные структуры – конформации белков. На определённом участке белковой молекулы из радикалов аминокислот формируется активный центр, который может специфично (комплемент
4 Взаимодействие белков с лигандами лежит в основе их функционирования. Изменения последовательности аминокислот в белках могут приводить к изменению пространственной структуры и функций данных белков и развитию заболеваний.
4 Основу жизнедеятельности любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции в живом организме протекают с участием природных биокатализаторов, называемых ферментами, или энзимами. Среди множества энергетически возможных реакций
4 В научной литературе на русском языке утвердились оба термина
4 Для практической медицины важность энзимологии обусловлена тем, что она даёт фармакологам инструмент направленного изменения метаболизма клетки путём воздействия определёнными химическими веществами на активность ферментов. Огромное количество фармац
6 Глава 1. Аминокислоты – свойства и строение
10 Глава 2. Белки. Уровни организации
17 Глава 3. Физико-химические свойства белков и их растворов
21 Глава 4. Нарушение и восстановление структуры нативных белковых молекул – денатурация, ренатурация и фолдинг
25 Глава 5. Биологические свойства белков
28 Глава 6. Классификации белков
31 По устойчивости к действию температуры
31 По форме молекул
31 Классификация по химическому строению
40 Глава 7. Методы изучения белков
47 Лабораторная работа № 1
47 «Исследование свойств белков»
47 Нингидриновая реакция
47 Ксантопротеиновая реакция
47 Ксантопротеиновая реакция обусловлена присутствием в белке циклических аминокислот – фенилаланина, тирозина и триптофана, которые при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные желтого цвета (реакция нитрования бенз
48 Полуколичественная оценка содержания белка в биологических жидкостях
49 Осаждение белков при нагревании
50 Осаждение белка органическими растворителями
50 В органических растворителях белки не растворяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации органических растворителей.
50 Необратимая денатурация белков солями тяжёлых металлов
50 Качественное определение фосфопротеинов в молочной сыворотке
52 Ситуационные задачи к разделу «Белки»
54 Глава 8. Ферменты. Основные понятия
54 Ферменты или энзимы (от лат. fermentum – брожение; от греч. enzyme – в дрожжах) – белки, рибосомы или комплексы РНК-белки, являющиеся биокатализаторами и ускоряющие химические реакции, за счёт изменения механизма реакции и понижения энергии активации
54 В ферментативном катализе выделяют следующие понятия
54 Ферменты характеризуются следующими свойствами, имеющими сходство с химическими катализаторами
54 1. не расходуются и не образуются в процессе реакции;
54 2. катализируют только энергетически возможные реакции;
54 3. не изменяют свободную энергию субстратов и продуктов реакции;
54 4. не смещают равновесия реакции, и ускоряют его наступление.
54 Между ферментами и химическими катализаторами имеются следующие различия
54 1. Ферменты являются белками и поэтому катализируют реакции в «мягких» условиях (давление 1 атм., температура 37 С и около нейтральное значение рН)15F .
54 2. Ферменты обладают физико-химическими свойствами, характерными для белков.
55 3. Для ферментов характерна более высокая эффективность, чем для неорганических катализаторов. Например, энергия активации разложения пероксида водорода 2Н2О2 → 2Н2О + О2 равна 75,2 кДж/моль. При добавлении неорганического катализатора (Pt) энергия а
55 4. Активность фермента регулируется и контролируется на генетическом уровне (на этапе синтеза белка-фермента и его фолдинга) и посредством низкомолекулярных соединений (эффекторов).
55 5. Ферменты обладают специфичностью, то есть способны катализировать реакции только с определёнными субстратами или химическими связями.
55 6. В организме человека, высших животных и растений основная часть метаболических процессов осуществляется полиферментными (мультиэнзимными) комплексами. В результате происходит многоэтапный процесс превращения исходных субстратов с минимальным росто
55 Глава 9. Классификация и номенклатура ферментов
55 На современном этапе развития биохимии известно более 3500 различных ферментов, название которых может быть тривиальным, то есть построено по принципу
55 Для ферментов имеющих тривиальное название также разработано и систематическое.
55 Выделяют 7 классов ферментов, отличающихся особенностями осуществляемых реакций, сродством к различным типам связей и прочими особенностями.
55 Класс 1 – Оксидоредуктазы – ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов (окислителя – акцептора и восстановителя – донора восстановительных эквивалентов (протонов и электронов)). Их систематическое назва
56 - дегидрогеназы и редуктазы – учувствуют в отщеплении или присоединении молекулы водорода. В качестве акцептора восстановительных эквивалентов от органического субстрата выступают коферменты – НАД+, НАДФ+, ФАД или ФМН
56 - оксидазы – переносят электроны и протоны на молекулярный кислород или катализируют окисление субстратов молекулярным кислородом в качестве акцептора электронов без его включения в молекулу субстрата;
56 - пероксидазы – синтезируют пероксид водорода для частичного или полного окисления органических субстратов или разрушают молекулы пероксидов (органических и неорганических);
57 - оксигеназы
57 Класс 2 – Трансферазы – осуществляют межмолекулярный перенос функциональных групп или групп атомов от молекулы донора на молекулу акцептора. Они подразделяются в зависимости от переносимой группы. Название этих ферментов составляют по формуле «донор
57 Коферментами чаще всего являются активные формы витаминов
57 - аминотрансферазы – осуществляют перенос аминогруппы с α-аминокислоты на α-кетокарбоновую кислоту, в результате образуются новые амино- и кетокислоты
57 - ацилтрансферазы – ферменты, переносящие ацильный остаток (остаток карбоновой кислоты) на субстрат;
57 - метил-трансферазы – осуществляют перенос одноуглеродного фрагмента;
58 - гликозилтрансферазы – переносят остатки активированных моносахаридов;
58 - киназы (фосфотрансферазы) – переносят фосфатные группы от макроэргов (чаще от АТФ) на субстраты;
58 Класс 3 – Гидролазы – катализируют реакции гидролиза (расщепления ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва). Подразделяют в зависимости от расщепляемой связи на 13 подклассов. Ввиду сложности многих субстратов у ряда ферменто
58 Гидролазы широко представлены ферментами желудочно-кишечного тракта (пепсин, трипсин, липаза, амилаза и другие) и лизосомальными ферментами. Осуществляют распад макромолекул, образуя легко адсорбируемые мономеры. Подклассы
58 Эстеразы – гидролизуют сложноэфирные связи (к ним принадлежат, например, липазы);
58 - Фосфатазы – гидролизуют фосфоэфирную связь с отщеплением фосфорной кислоты от субстрата;
59 - Гликозидазы – гидролизуют О- и N-гликозидные связи;
59 - Протеазы и пептидазы – осуществляют гидролиз пептидных связей у белков и пептидов;
59 - Нуклеазы – катализируют гидролиз связей в нуклеиновых кислотах.
59 Класс 4 – Лиазы (синтазы) – класс ферментов, который отщепляет группы от субстратов по негидролитическому (без участия воды) и неокислительному механизмам, часто с образованием двойных связей или циклических структур. Также могут осуществлять присоед
59 Ферменты делятся на подклассы в зависимости от природы атакуемой связи
59 - углерод-углерод лиазы – образуют или атакуют связи между атомами углерода
59 - углерод-кислород лиазы;
60 - углерод-азот лиазы;
60 - углерод-сера лиазы;
60 - углерод-галоген лиазы;
60 - фосфор-кислород лиазы;
60 - углерод-фосфор лиазы.
60 Класс 5 – Изомеразы – катализируют образование структурных, оптических и стереоизомеров за счёт внутримолекулярного превращения веществ. К их коферментам относятся пиридоксальфосфат, дезоксиаденозилкобаламин, глутатион, фосфаты моносахаридов (глюкозо
60 Выделяют подклассы изомераз в зависимости от типа реакции. Например
60 - рацемазы – осуществляют обратимое превращение L- и D-стереоизомеров;
60 - эпимеразы – изменяют конфигурацию при одном из хиральных атомов углерода, например, взаимопревращение α- и β-изомеров;
60 - внутримолекулярные оксидоредуктазы, например ферменты, катализирующие взаимопревращение альдоз в кетозы;
60 - внутримолекулярные трансферазы или мутазы – переносят функциональные группы внутри молекулы;
61 Класс 6 – Лигазы (синтетазы) – катализируют соединение двух молекул, сопряжённое с использованием энергии высокоэнергетических связей (например, АТФ). Коферментами этого класса являются нуклеотидные (УТФ) и биотиновые (витамин Н) производные и активн
61 Выделяют 6 подклассов по виду образуемой связи
61 Класс 716F – Транслоказы – отдельный класс ферментов, катализирующих перенос ионов или молекул через мембраны или их разделение в мембранах. Этот класс энзимов сформировался из ранее принадлежащих другим классам ферментов.
61 Выделяют 6 подклассов транслоказ, разделение основано на типе переносимой через мембрану частицы.
61 - ферменты, катализирующие транслокацию катионов водорода или протонов (H+);
61 - ферменты, катализирующие транслокацию неорганических катионов и их хелатов;
62 - ферменты, катализирующие транслокацию неорганических анионов;
62 - ферменты, катализирующие транслокацию аминокислот и пептидов;
62 - ферменты, катализирующие транслокацию углеводов и их производных;
62 - ферменты, катализирующие транслокацию иных соединений.
62 К ферментам этого класса не относятся каналы (поры), изменяющие конформацию между открытым и закрытым состоянием, в ответ на какое либо воздействие, а так же транспортеры, которые не зависят от фермент-катализируемых реакций.
62 Глава 10. Специфичность действия ферментов
62 Под специфичностью ферментов понимают их избирательное взаимодействие с определёнными субстратами, что отличает их от небиологических катализаторов. Специфичность основана на комплементарности структуры субстрата и активного центра фермента.
62 Выделяют четыре вида специфичности
62 Абсолютная специфичность – фермент катализирует превращения только одного субстрата. Например, уреаза расщепляет только мочевину, глюкокиназа фосфорилирует только D-глюкозу.
62 Относительная специфичность – фермент расщепляет определённый тип связи. Например, липаза гидролизует сложноэфирные связи нейтральных жиров, при этом жирнокислотный состав не влияет на этот процесс (если нейтральный жир в просвете кишечника остаётся
63 Относительная групповая специфичность – фермент расщепляет определённый тип связи, но в её образовании участвуют определённые функциональные группы. Такие ферменты обычно работают в процессе пищеварения. Например, пищеварительные ферменты, гидролизую
63 Стереохимическая специфичность – фермент катализирует превращение только определённого стереоизомера.
63 Пример стереохимической специфичности – гидратация фумарата (фумаровой кислоты) ферментом фумаразой
63 Примером стереохимической специфичности также является работа аспартазы, которая осуществляет отщепление (или присоединение) молекулы аммиака от аспарагиновой до фумаровой кислоты
64 Глава 11. Структура ферментов
64 Несмотря на то, что молекулярная масса различных ферментов колеблется в очень широком диапазоне, размеры белковых молекул ферментов намного превышают размеры их субстратов. Именно поэтому ферменты взаимодействуют с субстратами сравнительно небольшим
64 Рис. 18. Функционирование активного центра фермента.
64 Связывание субстрата с активным центром фермента осуществляется путём образования нековалентных связей (водородных, электростатических, гидрофобных) с аминокислотными остатками субстрат-связывающего участка. Это вызывает дестабилизацию связей в молек
65 По строению ферменты делятся на простые (однокомпонентные) и сложные (двух- и многокомпонентные) белки. Простые ферменты состоят из аминокислот. Сложные белки-энзимы состоят из белковой части – апофермента и небелковой части – кофактора или кофермент
65 Термин «кофермент» был введён в начале XX века и обозначал часть некоторых ферментов, которая легко отделялась от белковой молекулы и удалялась через полупроницаемую мембрану при диализе. Несколько позже было выяснено, что большинство ферментов состо
65 В зависимости от прочности связи апофермента и небелкового фактора в холоферменте различают коферменты и простетические группы. Коферменты связаны с апоферментом нековалентными связями и потому легко от него диссоциируют. Простетические группы связан
65 Кофакторы играют очень важную роль в ферментативном катализе.
65 - Они способствуют либо изменению трёхмерной структуры белка-фермента, что улучшает взаимодействие фермента с субстратом, либо изменению структуры субстрата.
65 - Коферменты (простетические группы), как правило, выступают в качестве дополнительных субстратов ферментативной реакции. Они могут быть донорами или акцепторами определённых химических группировок (например, метильной группы, аминогруппы) и электрон
65 Очень важную группу коферментов составляют вещества, осуществляющие перенос восстановительных эквивалентов в окислительно-восстановительных реакциях.
65 Важнейшие коферменты являются производными водорастворимых витаминов, они представлены в таблице 3.
65 Таблица 3.
65 Коферменты
67 Коферментами могут быть вещества невитаминной природы, которые синтезируются в клетках, например, аминокислоты, пептиды (глутатион, селеноглутатион), нуклеотиды, гем, порфирины, S-аденозилметионин (SAM), липоевая кислота, коэнзим А (HSKoA), коэнзим Q
67 Кофакторами являются ионы металлов, прочно связанные с активным центром энзима или с другими частями молекулы, и обеспечивающие его правильную трёхмерную структуру для проявления биологических свойств. К кофакторам принадлежат «металлы жизни» – Fe, C
67 Ферменты могут содержать как кофермент (простетическую группу), так и ионы металлов. Для проявления активности ряда ферментов (например, алкогольдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы) требуются как кофермент, так и один или несколько кофакторов-ионов
67 Кроме активного центра у ряда ферментов имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента, как правило, пространственно отделен от активного центра. К аллостерическому центру присоединяются вещества эффекторы, которые изменя
68 Глава 12. Каталитическая активность и механизм действия энзимов
68 Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум основным законам термодинамики
68 В ферментативных реакциях выделяют три основных этапа, описывающихся схемой
68 ????+????⇄????????→,????????−????????.⇄????+????,
68 где Е – энзим (фермент), S – субстрат, Р – продукт.
68 I этап – присоединение молекулы субстрата к активному центру фермента посредством слабых взаимодействий и образование фермент-субстратного комплекса (ES). Изменение энергии активации на этом незначительно (рис. 19). Для этого этапа важно сближение и
68 Рис. 19. Изменение свободной энергии катализируемой и не катализируемой ферментом реакции.
68 II этап – преобразование фермент-субстратного комплекса в один или несколько последовательных (промежуточных) комплексов, с образованием в активном центре конечного продукта реакции (EP). Для этого этапа характерно образование переходных состояний, с
69 Механизмы действия ферментов на этом этапе объясняются эффектом деформации субстрата, кислотно-основным и ковалентным катализом. Эффект деформации субстрата объясняет действие гидролаз, лиаз и трансфераз. После связывания с активным центром молекула
69 Если в активном центре энзима происходит перенос протонов (Н+) в безводной среде, то структура молекулы субстрата также в значительной мере изменяется (за счёт перераспределения электронных плотностей и зарядов). Этот ферментативный кислотно-основный
69 Возможен и процесс обратимого переноса функциональных групп от молекул субстрата к аминокислотным остаткам фермента с образованием и разрушением ковалентных связей – ковалентный катализ. Ковалентный катализ подразумевает наличие реакционных групп в а
69 Второй этап лимитирует скорость всего катализа. Скорость катализируемого процесса очень чувствительная к величине энергии активации, так уменьшение примерно на 5,7 кДж/моль приводит к увеличению скорости в 10 раз (например, изменение Еа соответствующ
70 III этап – отделение продукта реакции от фермента (Е + Р). Стадия непродолжительная и определяется скоростью диффузии продуктов реакции в окружающую среду. Фермент освобождается без изменений.
70 Суммарное повышение скорости катализируемой реакции может достигать 1014-1016 раз.
70 Взаимодействие субстрата с активным центром фермента объясняют следующие теории
70 1. Модель «ключ-замок», предложенная в 1890 г. Э. Фишером, предполагает, что субстрат имеет полное геометрическое соответствие активному центру энзима, то есть эти структуры полностью комплементарны друг другу. Данная модель позволяет описывать взаим
70 2. Модель индуцированного соответствия, предложенная в 1958 г. Д. Кошландом, предполагает, что активный центр фермента изменяет конформацию при присоединении субстрата. Кроме того, происходит и перестройка молекул субстрата, что объясняет групповое д
70 Рис. 20. Модели взаимодействия активного центра (АЦ) фермента с субстратом.
70 Глава 13. Кинетика ферментативного катализа
70 Основная функция ферментов заключается в повышении скорости химических реакций в соответствии с потребностями живого организма. Для понимания функционирования энзимов изучают кинетику их действия.
70 В 1913 г. Л. Михаэлис и М. Ментен предложили простую модель расчёта характеристик катализируемой ферментами реакции. Согласно математической модели на скорость ферментативной реакции влияют концентрации фермента и субстрата, температура, рН, наличие
71 Зависимость скорости от количества фермента – линейная, то есть чем больше молекул энзима, тем скорость выше. Однако количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характер
71 В 1973 г. была принята новая единица активности ферментов
71 Следует отметить, что в клетке концентрация ферментов всегда на несколько порядков меньше, чем их субстратов, и находится под жестким контролем генома. По этой причине данный фактор изменяется в ограниченных пределах в ходе жизни клеток и организма.
71 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представлена на рис. 21.
71 Рис. 21. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.
71 На гиперболической кривой графика выделяют три участка. При низкой концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональная концентрации субстрата и подчиняется кинетике первого порядка (рис. 21 и 22 А). На средней части графика эта зависимость
72 Рис. 22. Взаимодействие молекул субстрата (S) с активными центрами фермента (E) в зависимости от концентрации субстрата.
72 Согласно модели Михаэлис–Ментен было предложено уравнение, описывающее взаимосвязь скорости ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата
73 В целом уровень аффинности ферментов к субстратам в сравнении с другими взаимодействиями белков с лигандами характеризуется низкими значениями, что связано с выполняемой функцией. Слишком прочное связывание в комплексе «энзим-субстрат» сделало бы нев
73 Рис. 23. Сравнение аффинности (сродства) белков к лигандам.
73 Экспериментально установлено, что Vmax зависит от константы скорости диссоциации фермент-субстратного комплекса до свободного энзима и продукта реакции (kкат.) и общей концентрации фермента. Кинетическая константа (kкат.) по другому называемая числом
73 Использование графика, предложенного Михаэлисом и Ментен, не позволяет точно определить величины Vmax и Km. Для более удобного графического представления Г. Лайнуивер и Д. Берк преобразовали уравнение Михаэлис–Ментен по методу двойных обратных величи
73 ,1-????.=,,????-????.-,????-????????????..∙,1-,????..+,1-,????-????????????..=,,????-????.-,????-????????????.∙,????..+,[????]-,????-????????????.∙[????]..
73 Для ферментов, подчиняющихся кинетике Михаэлиса–Ментен, график зависимости ,1-????. от ,1-[????]. (в двойных обратных координатах по отношению к использованным ранее координатам v от [S] (рис. 21) представляет собой прямую линию (рис. 24)). Угол накл
74 Рис. 24. График в двойных обратных координатах (график Лайнуивера–Берка).
74 Графики в двойных обратных координатах очень удобны для выявления различий в механизмах ферментативного катализа, например, при действии на энзимы конкурентных и неконкурентных ингибиторов.
74 Физиологические концентрации субстратов обычно близки к величине Km, поэтому скорость работы ферментов не достигает предельных значений, которые могут быть достигнуты при изменениях внешних и внутренних условий протекания биохимической реакции.
74 Аллостерические ферменты (регуляторные ферменты, имеющие четвертичную структуру) не подчиняются кинетике Михаэлиса–Ментен. У таких энзимов зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имеет S-образную (сигмовидную) форму и описываются механ
75 Рис. 25. Сравнение кривых ферментов имеющих третичную и четвертичную структуры строения молекул.
75 Глава 14. Факторы, влияющие на ферментативную активность
75 Зависимость активности ферментов от температуры
75 Повышение температуры до определённых пределов оказывает влияние на скорость ферментативной реакции, подобно влиянию температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности в
75 Несмотря на то что критической для человека считают 42 С, ряд ферментов в пробирке могут выдержать и более высокую температуру. Такие ферменты называют термостабильными. Например, щелочная фосфатаза плаценты (но не других органов) выдерживает 60-мин
76 Рис. 26. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
76 Выделенные в чистом виде ферменты наиболее стабильны при низких температурах, поэтому ферментные препараты, используемые в медицине, обычно хранят при температуре 2-8 С.
76 Влияние рН на активность ферментов
76 Известно, что изменение рН влияет на степень ионизации функциональных групп аминокислотных остатков белка. Именно поэтому изменение рН обычно сопровождается изменением каталитической активности ферментов, хотя известны ферменты, сохраняющие свою акти
76 Рис. 27. Зависимость активности ферментов от значений рН.
76 В большинстве случаев ферменты наиболее активны в узком диапазоне значений рН, получившем название оптимума рН (рис. 27), отклонение от которого сопровождается резким снижением их каталитической активности. Чаще всего оптимум рН ферментов организма ч
77 Глава 15. Регуляция ферментативной активности
77 Тысячи биохимических реакций, составляющих основу процессов жизнедеятельности, формируют тесно переплетённые и связанные между собой сети метаболических путей. Быстрая ответная реакция клетки на постоянно меняющиеся условия внешней среды требует тонк
77 К первой группе относятся механизмы контролирующие количество ферментов в клетке, что связано как с изменением скорости синтеза, так и скоростью разрушения энзимов (компартментализация20F и генетическая регуляция).
77 Наиболее значимой в этом способе регуляции ферментативных реакций является генетическая регуляция. С этой точки зрения ферменты можно подразделить на три группы
77 Конституитивные – такие ферменты, которые образуются в клетке постоянно, независимо от наличия субстрата и их количество меняется незначительно (NO-синтаза, ферменты гликолиза, β-окисления жирных кислот, репарации ДНК).
77 Индуцируемые (адаптивные) – синтез этих ферментов возрастает при наличии соответствующих стимулов (индукторов).
77 Репрессируемые – образование таких ферментов в клетке при необходимости подавляется.
77 Изменение скорости синтеза фермента (индукция или репрессия) обычно зависит от количества определённых гормонов или метаболитов процесса. При быстром изменении условий этот путь не может поддерживать гомеостаз.
78 Вторая группа механизмом регуляции обеспечивает быстрое изменение скорости ферментативной реакции (доступность субстрата или кофермента; ограниченный (частичный) протеолиз проферментов; аллостерическая регуляция; белок-белковое взаимодействие; ковале
78 Также следует отметить, что среди множества ферментов, катализирующих химические реакции в клетках, объектами регуляции являются немногие из них. Они получили название регуляторных или ключевых ферментов. Как правило, ключевые ферменты
78 - катализируют неравновесные (необратимые) реакции;
78 - находятся в самом начале метаболического пути и(или) на развилке нескольких путей;
78 - являются катализаторами самых медленных (лимитирующих) реакций, определяющим скорость потока субстратов через весь метаболический путь.
78 15.1. Ингибирование активности ферментов
78 Ингибиторы – вещества, которые взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию фермент-субстратного комплекса. Ингибиторы делятся на две группы неспецифические и специфические. Действие неспецифических ингибиторов не связано с механизмом действи
78 Ингибиторы (I) взаимодействуют с ферментами (Е), образуя разные по степени прочности комплексы (ЕI). На основании этого признака ингибирование может быть обратимым и необратимым. По механизму действия ингибиторы делятся на два больших класса
78 Необратимое ингибирование происходит в случае образования прочных ковалентных связей между ингибитором и ферментом. Чаще всего модификации подвергается активный центр. Если вещества блокируют определённые группы активного центра энзима, то они называ
79 Рис. 28. Необратимое ингибирование активности химотрипсина.
79 В малых концентрациях ионы тяжелых металлов (например, Hg2+) необратимо блокируют HS-группы в активном центре ферментов. В то время как в больших концентрациях они способны вызывать инактивацию ферментов не специфически, связываясь с любыми HS-группа
79 Ряд лекарственных препаратов являются аналогами субстратов ферментов, однако в ходе их метаболизма образуются вещества, прочно связывающиеся с активным центром фермента и полностью прекращающие его работу. Такие вещества называются суицидными субстра
79 Обратимые ингибиторы связываются с ферментом, образуя слабые нековалентные связи. Результатом взаимодействия обратимого ингибитора с ферментом является его эффективное, практически мгновенное замедление скорости реакции, которое полностью исчезает пр
79 Конкурентное обратимое ингибирование
79 Ингибитор имеет структурное сходство с субстратом и конкурирует с ним за активный центр фермента22F (рис. 29). Особенностью конкурентного ингибирования является возможность усилить или ослабить ингибирование через изменение концентрации субстрата23F
80 Рис. 29. Взаимодействие ингибитора с ферментом в ходе конкурентного и неконкурентного ингибирования.
81 Классическим примером конкурентного обратимого ингибирования является ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой. В норме малоновая (пропандиовая) кислота образуется из ацетил-КоА в процессе биосинтеза жирных кислот. Патологичес
81 При данном ингибировании максимальная скорость реакции остаётся вполне достижимой при создании высоких концентраций субстрата. В данном случае максимальная скорость реакции (Vmax) не изменяется, константа Михаэлиса (Km) увеличивается (рис. 30).
81 Рис. 30. А. Влияние конкурентного ингибитора на график зависимости скорости реакции (Vo) от концентрации субстрата ([S]). В. Участок конкурентного торможения фермента в двойных обратных координатах (график Лайнуивера-Берка).
81 Неконкурентное обратимое ингибирование
81 В этом случае ингибирования конкуренция между субстратом и ингибитором отсутствует. Ингибитор связывается с другими участками молекулы фермента, изменяется конформация, в том числе и активного центра, в результате скорость ферментативной реакции сниж
82 Рис. 31. А. Влияние неконкурентного ингибитора на график зависимости скорости реакции (Vo) от концентрации субстрата ([S]). В. Участок неконкурентного торможения фермента в двойных обратных координатах (график Лайнуивера-Берка).
82 Неконкурентное ингибирование в чистом виде встречают очень редко. Чаще наблюдают смешанное ингибирование, когда под действием ингибитора происходит не только снижение Vmax, но и изменение Кm (рис. 32, Б). При этом ингибитор может связываться не тольк
82 В случае если кинетика ингибирования ферментативной активности характеризуется снижением Vmax Кm такой тип ингибирования называют бесконкурентным (рис. 32, А). Бесконкурентный ингибитор связывается с фермент-субстратным комплексом. Повышение концентр
82 Рис. 32. А – бесконкурентное ингибирование, Б – смешанное ингибирование.
83 На практике бесконкурентное и смешанное ингибирование наблюдается только для ферментов с несколькими субстратами.
83 15.2. Аллостерическая регуляция
83 Этот тип регуляции свойственен ферментам, в структуре которых, помимо активного центра, есть ещё один центр, называемый аллостерическим (от греч. alios – другой и stereos – пространственный). Он может находиться на значительном расстоянии от активног
83 Аллостерическое ингибирование может быть положительным и отрицательным. В качестве отрицательного регулятора может выступать конечный метаболит биохимического процесса или продукт данной реакции, т.е. включается механизм обратной отрицательной связи
83 А.
83 Б.
83 Рис. 33. А. Механизм регуляции активности фермента по принципу отрицательной обратной связи (схема). Конечный продукт метаболического пути (F) является аллостерическим ингибитором первого фермента этого пути (Е1). Б. Механизм регуляции активности фер
83 Если регуляторами являются начальный метаболит или субстрат реакции, то говорят о прямой регуляции, она может быть как положительной, так и отрицательной (рис. 33, Б). Также регулятором могут быть метаболиты биохимических путей, каким то образом связ
84 15.3. Ковалентная модификация
84 Ещё один быстрый способ регуляции активности фермента – ковалентная модификация, в ходе которой к белку присоединяется определённая химическая группа. В предыдущем разделе уже говорилось о фосфорилировании – присоединении фосфата к аминокислотным ост
84 Ковалентная модификация ферментов, как правило, обратима. В клетках существуют ферменты, возвращающие ковалентно модифицированные белки в исходное состояние. Например, протеинфосфатазы катализируют реакцию дефосфорилирования фермента (рис. 34).
84 Рис. 34. Регуляция активности ферментов способом ковалентной модификации (фосфорилирование–дефосфорилирование).
84 Примером регуляции активности ферментов путём ковалентной модификации является фосфорилирование и дефосфорилирование ключевых ферментов синтеза и распада гликогена. При снижении уровня глюкозы в клетке (например, при интенсивной физической нагрузке)
85 Фосфорилирование – не единственный способ обратимой ковалентной модификации ферментов в клетке. Необратимо к ферменту могут присоединиться метильные группы (метилирование), моносахариды (гликозилирование), жирные кислоты (ацилирование) и другие молек
85 15.4. Частичный протеолиз (активация зимогена)
85 Ограниченный (частичный) протеолиз белков подразумевает, что синтез некоторых ферментов осуществляется в виде более крупного предшественника (профермента или зимогена) и при поступлении в нужное место этот энзим активируется через отщепление от него
85 Примером служит активация протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта (трипсиноген, пепсиноген, химотрипсин (рис. 35) прокарбоксипептидазы), факторов свёртывающей системы крови, лизосомальных ферментов (катепсины).
85 Рис. 35. Ограниченный протеолиз и связанные с ним конформационные изменения молекулы образуют активный цент химотрипсина (ХТ). Последовательный протеолиз образует про-химотрипсин (Про-ХТ), π-химотрипсин (π-ХТ) и, в конечном итоге, α-химотрипсин (α-ХТ
85 Секреция ряда ферментов за пределы клетки в неактивном состоянии позволяет предохранить клетки от повреждения (пищеварительные ферменты) или сохранить белок в плазме крови до наступления определенного момента (факторы свёртывания крови, белки системы
86 15.5. Белок-белковое взаимодействие (ассоциация-диссоциация четвертичных ферментных комплексов)
86 Белок-белковое взаимодействие – это обладающие высокой специфичностью физические контакты между двумя и более белками. Термин белок-белковое взаимодействие обозначает ситуацию, когда в качестве регулятора выступают не метаболиты биохимических процесс
86 Рис. 36. Организация четвертичного комплекса активного фермента.
86 При диссоциации регуляторных субъединиц активность может как уменьшаться, так и увеличиваться (например, при действии на протеинкиназу А цАМФ происходит диссоциация неактивного тетрамера и образование активного димера (рис. 36)).
86 Глава 16. Изоферменты
86 Изоферментами называют каталитически сходные множественные формы фермента у организмов одного вида, отличаемые по своим физико-химическим и иммунологическим свойствам.
86 Различают следующие изоферменты
86 • Генетически независимые белки, кодируемые разными генами. Например, цитозольная и митохондриальная формы малатдегидрогеназы (МДГ), катализирующие обратимую реакцию дегидрирования малата
87 • Олигомерные ферменты, состоящие из разных субъединиц. Например, фермент гликолиза лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию дегидрирования молочной кислоты (лактата)
87 Фермент является тетрамером, который может быть построен из двух типов субъединиц – H и M. Они получили своё название по первым буквам органов, из которых были выделены (от англ. heart – сердце и muscle –мышца). Субъединичный состав ЛДГ в разных ткан
87 Рис. 37. Изоформы лактатдегидрогеназы. Строение различных изоформ ЛДГ. Распределение на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ в различных органах. Содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме и при патологии (электрофореграммы – с
87 Преобладание того или иного изофермента в определённых тканях имеет большое биологическое значение. Например, в тканях с преобладанием анаэробного метаболизма (скелетных мышцах, печени) присутствует ЛДГ5. Данный изофермент нечувствителен к ингибирова
88 Глава 17. Ферменты в медицине
88 Исследование активности внутриклеточных ферментов в биоптатах тканей или форменных элементах крови позволяет обнаружить увеличение, снижение, а также полное их отсутствие в организме. В одних случаях изменение активности ферментов может являться крит
88 Большинство ферментативных реакций в организме протекает внутри клеток в определённых субклеточных компартментах. В биологические жидкости, в первую очередь в кровь, внутриклеточные ферменты попадают в результате гибели клеток или увеличения проницае
88 В ходе нормальной жизнедеятельности внутриклеточные ферменты в незначительном количестве поступают в кровоток и другие биологические жидкости. Однако при массовой гибели клеток их количество и активность значительно возрастает, что может быть использ
88 Дополнительным подтверждением диагноза инфаркта миокарда служит обнаружение активностей ферментов АСТ и ЛДГ в крови больных. При инфаркте миокарда активность АСТ повышается через 4-6 ч; максимум активности наблюдают в течение 2-3 дней. Уровень ЛДГ та
89 Рис. 38. Схема выделения внутриклеточных ферментов в кровь при заболеваниях. Изменения активности креатинкиназы (изоформа МВ), АСТ и ЛДГ, и повышение концентрации сердечного тропонина при инфаркте.
89 При гепатите возрастает активность изоформ ЛДГ4 и ЛДГ5, аланинаминотрансферазы (АЛТ), орнитинкарбамоилтрансферазы, уроканиназы и некоторых других, что связано с разрушением гепатоцитов (рис. 37).
89 Нарушение синтеза определённых ферментов обычно приводит к возникновению заболеваний, получивших название энзимопатий. В результате нарушений в работе фермента возникают следующие последствия
89 - избыточно накапливаемые вещества становятся токсичными в высоких концентрациях;
89 - физиологически нормальные вещества препятствуют нормальному проявлению функции энзимов;
89 - продукты реакции, образуемые ферментом чрезвычайно необходимы другим энзимам.
89 Различают врождённые и приобретённые энзимопатии. Врождённые энзимопатии – это патологии, которые являются следствием изменений участков ДНК (генов) в результате мутаций или действия веществ блокирующих нормальные матричные синтезы и репарацию ДНК. Э
90 Энзимотерапия – использование ферментов и регуляторов действия ферментов (активаторов и ингибиторов) в качестве лекарственных средств. В одних случаях это может быть заместительная терапия – применение ферментных препаратов, которые восполняют дефици
90 Примером такого рода лечения может быть назначение натурального желудочного сока или смеси соляной кислоты с пепсином при гастритах с пониженной секрецией. Ещё одним примером служит использование ферментов поджелудочной железы животных или полученных
90 Цитохром с – белок, участвующий в процессах тканевого дыхания. Его применяют при асфиксии новорождённых, при гипоксии тканей – астматические состояния, сердечная недостаточность, нарушения мозгового и периферического кровообращения и т.п.
90 Рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза входят в состав глазных капель для лечения вирусных конъюнктивитов, также при нанесении на рану они разжижают гной, при ингаляциях уменьшают вязкость слизи, деполимеризуя нуклеиновые кислоты в мокроте.
90 Стрептокиназа и урокиназа используются как активаторы фибринолиза при тромбозах. Трипсин ингалируют при бронхолёгочных заболеваниях для разжижения густой и вязкой мокроты. Фицин используется в фармацевтической промышленности в качестве добавки к зубн
91 Лабораторная работа № 2
91 «Изучение свойств ферментов»
91 Специфичность действия фермента
91 Абсолютная специфичность проявляется в случае, если фермент катализирует превращение единственного субстрата.
91 Опыт 1.
91 Опыт 2.
92 Сравнение каталитической активности фермента и минерального катализатора. Влияние температуры и рН среды на работу ферментов.
92 Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов
94 Ситуационные задачи к разделу «Ферменты»
94 1. Белки пищи гидролизуются ферментом желудочного сока пепсином. В норме оптимум рН пепсина – 1,5-2,0. Почему у больных с гипоацидным гастритом, при котором повышается рН желудочного сока, нарушается переваривание белков в желудке? При ответе
94 а) укажите, к какому классу и подклассу ферментов относится пепсин, и какие связи расщепляет пепсин в белках пищи;
94 б) нарисуйте график зависимости активности пепсина от рН и объясните, что такое оптимум рН ферментов;
94 в) объясните, почему повышение рН желудочного сока снижает активность пепсина и нарушает переваривание белков пищи в желудке.
94 2. У студента на фоне длительной умственной нагрузки появились симптомы повышенной раздражительности, утомляемости, учащённое сердцебиение. Врач назначил месячный курс приёма препарата магнеВ6, и уже через неделю студент заметил улучшение состояния з
94 а) объясните, какую роль играют ионы металлов в функционировании ферментов, как называется небелковая часть, входящая в состав ферментов;
94 б) укажите роль иона магния в функционировании ферментов;
94 в) объясните роль витаминов в работе ферментов.
94 3. При террористической атаке в 1995 г. в токийском метро, где пострадали более 6000 человек и 18 погибли, было использовано одно из самых сильных отравляющих веществ – зарин, относящийся к группе органических фторфосфатов. Основными симптомами отрав
94 а) назовите ферменты-мишени, с которыми взаимодействуют органические фторфосфаты, и опишите особенности строения их активного центра;
94 б) укажите, с какой аминокислотой активного центра взаимодействуют органические фторфосфаты, и обратимо ли это взаимодействие;
94 в) напишите реакцию, снижение скорости которой вызывает перечисленные выше симптомы, и объясните механизм развития токсического действия ФОС.
94 4. Фермент креатинкиназа (КК) может использоваться в качестве биохимического маркера при диагностике инфаркта миокарда, а также при травмах и повреждениях скелетных мышц. Какая изоформа КК указывает на поражение сердечной мышцы, а какая – на травму с
95 а) опишите олигомерное строение КК, раскройте термин «изоферменты», назовите изоформы КК, укажите, в каких клетках преобладают те или иные изоформы КК;
95 б) назовите данное направление использования фермента в медицине и укажите, на чем оно основано;
95 в) объясните, почему определение изоформ КК в крови помогает в постановке диагноза и почему одна из изоформ практически не определяется в крови, даже при поражении соответствующих клеток.
95 5. При инфаркте миокарда в сыворотке крови больных изменяется активность ЛДГ, которая поступает из повреждённых клеток сердечной мышцы. Обоснуйте целесообразность применения энзимодиагностики для установления причины заболевания. При ответе
95 а) напишите реакцию, катализируемую ЛДГ;
95 б) назовите кофермент ЛДГ, напишите формулу витамина, входящего в его состав;
95 в) опишите строение изоферментов ЛДГ, особенности распределения их в тканях;
95 г) назовите другие белки – биомаркеры инфаркта миокарда и обоснуйте важность биохимического анализа крови при мониторинге лечения.
95 6. Метанол (древесный спирт) очень токсичен
95 NAD+ + CH3OH → NADH+H+ + H2C=O (формальдегид)
95 NAD+ + C2H5OH → NADH+H+ + CH3СН=O (ацетальдегид)
95 Почему при отравлении метанолом больному в качестве антидота вводят 100 мл 30 % этанола? Для ответа
95 а) дайте определение кинетической характеристике фермента Км; нарисуйте график зависимости скорости реакции от концентрации спирта, на графике покажите Км для этанола и метанола, если известно, что максимальная скорость реакции окисления у них одинак
95 б) объясните, к какому из спиртов (метанолу или этанолу) фермент имеет более высокое сродство; укажите, к какому классу относится алкогольдегидрогеназа;
95 в) поясните, какое значение для процесса катаболизма метанола имеет отношение NAD+/NADH;
95 г) сделайте вывод об эффективности антидотовой терапии.
95 7. Мужчине 50 лет поставили диагноз «алкоголизм». Когда его в очередной раз доставили в больницу, врач обнаружил симптомы кардиомиопатии (поражение сердечной мышцы) – аритмию, тахикардию. Кроме того, были выявлены потеря чувствительности в области ру
96 а) дайте определение понятию «витамин» и «кофермент»;
96 б) приведите примеры реакций, в которых участвует вещество, образовавшееся из указанного витамина; укажите значение данных реакций и ответьте на основной вопрос задачи;
96 в) опишите возможные связи между дефицитом витамина В1 и поражением миокарда.
96 Ответ.
96 а) Витамины – незаменимые органические факторы питания, в организме не синтезируются и поступают с пищей. В организме витамины превращаются в соответствующие коферменты, в частности витамин В1 превращается в кофермент тиаминдифосфат (ТДФ). Коферменты
96 б) ТДФ участвует как кофермент в реакциях декарбоксилирования альфа-кетокислот, таких как пируват и α-кетоглутарат. Эти реакции обеспечивают клетки энергией в виде АТФ. При алкоголизме развивается дефицит тиамина, потому что алкоголь блокирует трансп
96 в) Молекулярные механизмы развития кардиомиопатии могут быть различными
97 список рекомендуемой литературы
97 6. Биологическая химия
97 7. Чиркин А.А. Биохимия
97 8. Harvey R.A. Biochemistry / R.A. Harvey, D.R. Ferrier. – Philadelphia
%
Одностраничный режим чтения
Основной режим чтения
Тэги
Заметки
Отправить на печать
Видео
Доп.материалы
Содержание

Биохимия: Белки и ферменты

Авторы: Бондаревич Е. А., Коцюржинская Н. Н., Караваева Т. М.
Вернуться на сайт
Открыть для копирования
В книге
На странице
Скачать выбранные
/ 97
1 97
Копирование: 48 (48) страниц | Печать: 19 (19) страниц
Ограничения на печать и копирование введены правообладателем. В скобках
указан остаток по каждому пункту с учетом того, что Вы уже использовали