Содержание
4 ВВЕДЕНИЕ
6 ТЕМА 1. МЕТОДЫ ОЧИСТКИ И РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
6 Занятие 1
13 Лабораторная работа № 1
13 Обессоливание белковых растворов фильтрованием через гель сефадекса g-25
16 Занятие 2
18 Лабораторная работа № 2
18 Разделение смеси белков методом ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе
21 Занятие 3
25 Лабораторная работа № 3
25 Высаливание белков и белковых фракций. Фракционирование протеасом, определение химотрипсиноподобной активности 20S и 26S пулов протеасом
28 ТЕМА 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ in situ ГИБРИДИЗАЦИИ
28 Занятие 1
30 Принцип FISH-метода
34 Лабораторная работа № 4
34 Определение наличия амплификации гена Her2/neu в опухолевых клетках методом fish
35 Для подготовки препаратов из фиксированных в формалине, залитых парафином тканей можно применять следующую методику
36 6. Денатурация ДНК в образце
36 Подготовка растворов зондов должна быть согласована по времени с денатурацией ДНК в образцах так, чтобы все было подготовлено для этапа гибридизации в одно и то же время.
36 1. Заранее подогрейте до 37 (С увлажненную камеру для гибридизации (воздухонепроницаемый контейнер с кусочком влажной промокательной бумаги или бумажного полотенца размером примерно 1 х 3 дюйма, прикрепленным к стенке контейнера), поместив ее перед .
37 2. Перед использованием раствора для денатурации убедитесь, что его рН составляет 7,0–8,0 при комнатной температуре. Налейте раствор для денатурации в емкость Коплина и поместите на водяную баню с температурой 72(1 (С по крайней мере на 30 минут или.
37 3. Отметьте области гибридизации с помощью алмазного резца.
37 4. Проведите денатурацию ДНК в образце, погрузив подготовленные стекла в раствор для денатурации с температурой 72(1(С ((6 стекол на 1 емкость Коплина) на 5 минут. Не проводите денатурацию более 6 препаратов в одной емкости Коплина одновременно. С ..
37 5. Извлеките стекла из 70 %-ного этанола. Повторите этап 5 с 85 %-ным этанолом, а затем – 100 %-ным этанолом.
37 6. Удалите со стекла избыток этанола, приложив его нижний край к промокательной бумаге, и вытрите обратную сторону стекла лабораторной салфеткой.
37 7. Просушите стекла на нагревателе для стекол в течение 2–5 минут при 45–50 (С.
37 7. Подготовка зондов
37 1. Дайте раствору зондов прогреться до комнатной температуры, пока его вязкость не уменьшится достаточно для точного пипетирования.
37 2. Перемешайте на вортексе. Отцентрифугируйте каждую пробирку в течение 2–3 с с помощью настольной микроцентрифуги, чтобы содержимое пробирки стекло на дно пробирки. Снова аккуратно перемешайте на вортексе.
37 8. Гибридизация
37 1. Нанесите 10 мкл смеси зондов на отмеченную область-мишень стекла. Сразу накройте эту область покровным стеклом размером 22 х 22 мм и дайте смеси равномерно распределиться под покровным стеклом. Пузырьки воздуха мешают гибридизации, поэтому не допу
37 2. Закрепите покровное стекло резиновым герметиком следующим образом. Наберите герметик в шприц на 5 мл. Выдавите его небольшое количество по краям покровного стекла, захватывая и покровное, и предметное стекла, формируя таким образом изолирующий сл.
38 3. Поместите стекла в предварительно нагретую увлажненную камеру для гибридизации. Плотно закройте камеру крышкой и инкубируйте при 37 (С в течение ночи (14–18 часов).
38 9. Промывка после гибридизации
38 1. Налейте буфер для промывки после гибридизации (2Х SSC/0,3 % NP-40) в емкость Коплина. Подогрейте буфер, поместив емкость Коплина на водяную баню с температурой 72(1 (С по крайней мере на 30 минут или пока раствор не нагреется до 72(1 (С. Налейте б
38 2. Удалите герметик с первого стекла, аккуратно потянув его пинцетом.
38 3. Погрузите стекла в буфер для промывки после гибридизации комнатной температуры до удаления с них покровных стекол.
38 4. После этого удалите избыток жидкости, промокнув край стекол, и погрузите их в буфер для промывки после гибридизации с температурой 72(1 (С на 2 минуты ((6 стекол на 1 емкость).
38 5. Извлеките каждое стекло из промывочной бани и высушите их на воздухе в темноте в вертикальном положении. (Подойдет закрытый ящик или полка внутри закрытого шкафа.)
38 6. Нанесите 10 мкл красителя DAPI на отмеченную область стекла и накройте покровным стеклом. До проведения подсчета храните препараты в темном месте.
38 10. Оценка приемлемости препарата
38 Приемлемость препарата оценивается по следующим критериям
38  Интенсивность сигнала зонда
38  Фон
39 11. Подсчет сигналов
39 Осмотрите несколько участков опухолевых клеток с помощью объектива 40Х для оценки возможной гетерогенности. Выберите участок с отдельным расположением ядер; по возможности избегайте мест со слабым гибридизационным сигналом. Используя объективы 63Х ил
41 ТЕМА 3. МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ИНФОРМАЦИОННЫЙ ПОТОК – ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ РНК И ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ
41 Занятие 1
45 Лабораторная работа № 5
45 Получение препарата внеклеточных везикул – экзосом из биологических жидкостей методом двойного
45 ультрацентрифугирования с ультрафильтрацией
48 ТЕМА 4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ
50 Лабораторная работа № 6
50 Определение молекулярной массы белков фильтрованием через гель сефадекса g-100
55 ТЕМА 5. ОСНОВЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
55 Занятие 1
59 Лабораторная работа № 7
59 Основы культивирования клеток. Работа с адгезивными и суспензионными культурами. Подсчет клеток при культивировании
64 Литература
64 Основная
64 Дополнительная
%
Одностраничный режим чтения
Основной режим чтения
Тэги
Заметки
Отправить на печать
Видео
Доп.материалы
Содержание

Практикум по молекулярной биологии

Авторы: Юнусова Н. В., Кузьменко Д. И., Кайгородова Е. В., ... Сомов А. К.
Серебров В. Ю.
Вернуться на сайт
Открыть для копирования
В книге
На странице
Скачать выбранные
/ 65
1 65
Копирование: 32 (32) страницы | Печать: 13 (13) страниц
Ограничения на печать и копирование введены правообладателем. В скобках
указан остаток по каждому пункту с учетом того, что Вы уже использовали